Сравнение микрокалориметрического и спектрофотометрического методов определения стабильности белков
Введение
ДСК и спектроскопия в УФ/видимом диапазоне представляют собой эффективные методы для описания температурной стабильности структурных доменов белков и нуклеиновых кислот. Хотя спектроскопия и дает представление о температурной стабильности доменов, только ДСК позволяет напрямую измерить энтальпию процесса разворачивания молекул. Следовательно, ДСК позволяет провести более полный анализ термодинамических свойств полипептида, чем спектроскопия в УФ/видимом диапазоне.
Экспериментальные методы:
Метод иллюстрируется на примере плавления плазмидной ДНК pBR322 (Volker et al., Biopolymers, 50, 303-318, 1999). ДНК нагревали со скоростью 0.1°C/мин для спектроскопических измерений и 1°C/мин – для измерений ДСК. Данные были подвергнуты деконволюции, чтобы можно было сравнить результаты спектроскопии и калориметрии.
Рисунок 1.
Краткое изложение:
На Панели А Рисунка 1 представлены данные спектроскопии в УФ/видимом диапазоне, а на Панели В представлены данные, полученные с помощью Nano DSC. В обоих наборах данных деконволютированные пики отражают совокупное плавление структурных доменов плазмиды. Важно отметить, что на Панели А представлено усреднение по 12 независимым оптическим сканированиям, а на панели В представлено усреднение по двум независимым ДСК-сканированиям. Таким образом, благодаря десятикратно большей скорости сканирования и меньшему количеству сканирований, ДСК позволяет получить данные исключительного качества за гораздо меньшее время, чем спектроскопия УФ/видимого диапазона.
Величина, форма и распределение видимых глазом пиков в обоих наборах данных являются сходными, однако ДСК выявляет некоторые особенности, не очевидные на спектроскопических данных. Volker et al. впоследствии использовали ДСК для определения термодинамического вклада конкретных сегментов плазмидной ДНК, внося в последовательность вставки и удаления, что позволяет охарактеризовать эффекты аллостерических молекул и соседних доменов на термодинамические свойства последовательности.
Характеристики Nano DSC:
- Активный объем ячейки: 0.3 мл
- Фиксированные платиновые капиллярные ячейки: конфигурация капилляров задерживает начало необратимой агрегации, а платина является химически стойким материалом, обладающим прекрасными температурными характеристиками. Очистка агрессивными реагентами проводится легко и быстро, в результате чего устраняются проблемы, связанные с загрязнением ячейки для образца
- Рабочий диапазон температур: от -10 до 130°C
- Одинаковая чувствительность и воспроизводимость данных при сканировании с нагреванием и с охлаждением
- Создание повышенного давления в ячейке с образцом под контролем компьютера позволяет вести сканирование при температуре, превышающей температуру кипения образца
- На выбор предлагаются три режима: изотермический, температурное сканирование и изменение давления (для определения парциального удельного объема образца), без необходимости модификации оборудования или программного обеспечения
- В комплект входит станция дегазации/модуль очистки